Рисунок 1 – Экспрессированный белок с флуоресцентной меткой в живой клетке, освещенный с помощью флоуресцентного микроскопа полного внутреннего отражения (TIRF) с возбуждением при 488 нм и поглощением при 530 нм. Изображение было одновременно получено на Aries 16 (изображение A, слева, размер пикселя 16 мкм) и EMCCD (изображение B, справа, размер пикселя 16 мкм), время интегрирования составило 30 мс, объектив – 60 х. Изображения были получены Dr. Zsombor Koszegi из медицинской школы Бирмингемского университета
Справочная информация
Dr. Correia специализируется на съемке живых клеток для изучения метаболизма и системных исследований. Доктор заинтересовался камерой Aries 16 после того, как услышал о ее возможностях съемки при низкой освещенности.
Методика исследования
Одна из методик, которую использует команда для анализа и отслеживания положения отдельных белков, помеченных флуорофором, в живых клетках – флоуресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF). От камеры требуется не только обнаруживать белки при слабом освещении, но и отличать их от других флуоресцентных частиц в образце. В настоящее время группа использует технологию EMCCD, за счет ее способности различать сигналы при слабом освещении. Были также опробованы и другие технологии (объединенные SCMOS), но, по-видимому, они не соответствовали требованиям.
Эксперимент
Камера Aries 16 сравнивалась с ранее установленной камерой EMCCD. Обе они имели одинаковый размер пикселя 16 микрон. Сравнение проводилось с использованием TwinCam (Cairn Research Ltd) с разветвителем сигнала 50:50, подключенным к микроскопу Nikon Ti-2 с системой освещения iLAS для TIRF.
Результаты
На рисунке 1 показано, что Aries 16 имеет схожее с EMCCD соотношение сигнал/шум, но со значительно большим полем зрения, в результате чего получается охватить больше информации в кадре. «Мы сравнили Aries 16 с нашей существующей камерой EMCCD, и первоначальные исследования не выявили разницы в соотношении сигнал/шум. Дополнительным преимуществом по сравнению с EMCDD, помимо цены, является широкое поле зрения, что помогло получить больше данных в поле зрения камеры» – сказал Dr. Correia.
Рисунок 2 – Dr. Correia
Камера Aries, основанная на sCMOS матрице, не подвержена избыточному шуму (коэффициенту F = 1,41). Эта технология превосходит преимущества малошумящей EMCCD матрицы, работающей в режиме усиления. Камера Aries 16 имеет высокую емкость пикселя (73 000 e-), в то время как у EMCCD полная емкость снижается за счет коэффициента усиления. Наконец, камера Aries имеет в 1,83 раза большую площадь активной области.
На рисунке 3 показано сравнение линейных профилей (без коррекции на смещение или преобразование усиления) между Aries 16 и EMCCD. У Aries пиковый сигнал находится на отметке 500, в результате чего получается 200-300 уровней серого. Тем временем у EMCCD пиковое значение составляет 850 с фоном на 580, что приводит к 270 градациям серого.
Рисунок 3 – Сравнение уровней серого для Aries 16 (гистограмма слева) и EMCCD (гистограмма справа)
Стоит также отметить, что, в отличие от технологии EMCCD, здесь нет экспортного контроля или требований к хранению документации о физическом местоположении или пользователях изделия для производителей камер или местных органов власти.
Сравнение с классической камерой на sCMOS матрице с размером пикселя 6.5 мкм
Для увеличение размера пикселя и соотношения сигнал/шум часто применяется бининг. Однако, при объединении пикселей шум считывания увеличивается пропорционально коэффициенту бининга. Например, при объединении 2 пикселей шум считывания увеличится с 1,6 e- до 3,2 e-. Шум у камеры Aries, в свою очередь, составляется 0,8 e- без необходимости в бининге. Для обычных флуоресцентных систем это может не играть роли, но при работе в условиях очень низкой освещенности, например, с одиночными молекулами, повышенный уровень шума считывания становится критическим.
- Размер пикселя: 16 мкм;
- Шум считывания: 0,8 e-;
- Пиковая квантовая эффективность: 90 %;
- Интерфейс: CameraLink & USB3.0.
